Среды для выделения, культивирования и идентификации холерного вибриона

а) Основной раствор пептона. Состав:
Пептон сухой — 100,0
Натрия хлорид (NaCl) — 50,0
Калия нитрат (KNO3) — 10,0
Натрия карбонат (Na2CO3) — 25,0
Дистиллированная вода — 1000,0 мл
pH 8,4±0,1

В холодную дистиллированную воду погружают пептон, хлорид и карбонат натрия. Смесь кипятят при постоянном помешивании до полного растворения пептона, не допуская его пригорания, затем добавляют нитрат калия. Проверяют реакцию среды, если нужно, pH доводят до 8,5±0,1. Раствор фильтруют через миткалевый или бумажный фильтр, разливают в посуду и стерилизуют в автоклаве 20 мин при 121°С. Основной раствор пептона сохраняется до 2 лет.

б) Среды для транспортировки и обогащения материала:

1. Пептонная вода 1%. Для получения 1%-ной пептонной воды основной раствор пептона разводят в 10 раз дистиллированной водой. После установления pH 8,5±0,1 разливают в пробирки или во флаконы и стерилизуют 20 мин при 116°С.

1%-ную пептонную воду можно готовить и непосредственно из отдельных компонентов, взяв навески в 10 раз меньше указанных в рецепте основного пептона. Технология приготовления такая же, как и основного пептона.

2. Пептонная вода с теллуритом калия. В 1%-ную пептонную воду, pH 8,5±0,1, после автоклавирования добавляют тел-лурит калия в конечном разведении 1:100 000 или 1:200 000. Предварительно готовят рабочий 0,1%-ный раствор теллурита калия (1:1000), прокипяченный в водяной бане 30 мин. Срок хранения рабочих растворов — 7 дней.

в) Среды для культивирования, выделения и идентификации холерного вибриона:

1. Щелочной мясопептонный агар. Состав:
Мясная вода — 1000,0 мл
Пептон — 10,0
Натрия хлорид (NaCl) — 5,0
Агар — 20,0
pH 8,2±0,2

В мясную воду вносят пептон и хлорид натрия. Смесь перемешивают и подщелачивают 20%-ным раствором едкого натра до pH 8,3±0,1. Затем добавляют агар и содержимое помещают в автоклав и обрабатывают вначале текучим паром в течение 30-40 мин, а затем при 121°С 20 мин. Если мясопептонный агар варят на плите, среду кипятят до полного растворения агара при постоянном помешивании.

Для получения прозрачной агаровой среды ее после варки с целью отстоя оставляют на 2-3 ч в автоклаве или помещают в термостатную комнату при температуре 43±2°С. Время отстоя лучше продлить до 18-20 ч. Отстоявшийся агар осторожно, не взбалтывая, сливают с осадка на плотный ватно-марлевый фильтр. В фильтрате уточняют реакцию среды, если требуется, подкисляют ее, но подщелачивать агар на данном этапе не рекомендуется во избежание выпадения осадка при стерилизации готовой среды. Профильтрованный агар разливают в посуду и стерилизуют при 121°С 20 мин.

2. Элективная среда типа TCBS-arapa, сухая (ФГУН ГНЦ прикладной микробиологии, г. Оболенск). TCBS-агар предназначен для выделения холерных и НАГ-вибрионов из клинического материала (испражнений, рвотных масс, содержимого желчного пузыря, а также суспензии, приготовленной из слизистой оболочки кишечника трупов).

Среда TCBS-агар состоит из панкреатического гидролизата рыбной муки, дрожжевого экстракта, сахарозы, железа цитрата, натрия хлорида, желчи крупного рогатого скота, натрия тиосульфита, бромтимолового синего, тимолового синего и агара.

Препарат в количестве, указанном на этикетке для конкретной серии питательной среды, тщательно размешивают в 1000,0 мл дистиллированной воды. Смесь доводят до кипения, кипятят 1 мин при постоянном перемешивании.

Готовую среду охлаждают до температуры 40-50°С, разливают в чашки Петри слоем 5,0-6,0 мм. Подсушивают на столе с открытыми крышками в течение 1 ч при комнатной температуре.

Готовая среда темного сине-зеленого цвета.

Посев материала на среду TCBS производят из пленки, образовавшейся на поверхности жидкой среды накопления, штрихом для получения изолированных колоний.

Результаты роста учитывают через 18-20 ч инкубации при 37°С. Колонии холерного и НАГ-вибрионов, расщепляющие сахарозу с образованием кислоты, — ярко-желтые диаметром 1,5-2 мм. Сопутствующая микрофлора на среде TCBS не растет, за исключением протеев, образующих мелкие колонии бурого цвета.

3. Элективная среда СЭДХ, сухая. Используется как элективная среда для выделения и дифференциации холерного вибриона (производства Ростовского противочумного НИИ).

Состав, г/л:
Пептон D — 6,0
Натрия карбонат — 1,0
Препарат «ПТ» —2,0
Бромтимоловый синий — 0,04
Агар — 10,0
pH 8,0±0,2

Сухую среду в количестве, указанном на этикетке, размешивают в 1000,0 мл дистиллированной воды, ставят на 15-20 мин для набухания агара. Затем на небольшом огне доводят до кипения, кипятят 5 мин при постоянном помешивании до полного расплавления агара. Цвет готовой среды темно-синий.

Среду, не фильтруя и не стерилизуя, разливают в стерильные чашки Петри слоем 4,0-5,0 мм. Чашки со средой можно хранить в течение 5 сут. в холодильнике при температуре 6±2°С.

Учет результатов проводят через 20-24 ч инкубации в термостате при 37°С. Колонии холерного и НАГ-вибриона, окисляющие сахарозу, — ярко-желтого цвета.

4. Маннозо-сахарозная среда. Состав, г/л:
1,5%-ный питательный агар — 1000,0 мл
Манноза — 1,0
Сахароза — 10,0
Сернокислое железо (FeSO4*7H2O) — 0,2
Тиосульфит натрия (Na2S2O3*5H2O) — 0,08
Сульфит натрия (Na2SO3*7H2O) — 0,4
0,2%-ный раствор фенолового красного — 10,0 мл

После расплавления агара вносят в него навески ингредиентов, доводят pH до 8,0, разливают в пробирки по 5-7,0 мл и стерилизуют при 115°С 15 мин. Готовую среду после стерилизации скашивают так, чтобы получить столбик и косяк.

При разложении сахарозы выросшая культура вызывает изменение цвета всей среды; при разложении маннозы цвет изменяется только в глубине столбика.

5. Среда Кодама. В 1%-ную пептонную воду добавляют 0,5% растворимого крахмала. Среду разливают в стерильные пробирки и стерилизуют 20 мин при 112°С. Для оценки результатов расщепления крахмала используют реактив Люголя.

6. Среда для определения декарбоксилаз и дигидролаз лизина, орнитина, аргинина. Состав основы, г/л:
Пептон — 5,0
Дрожжевой экстракт — 25,0 мл или сухой 3,0 г
Глюкоза — 1,0
Натрия хлорид (NaCl) — 5,0
Натрия карбонат (Na2CO3) — 0,1
Бромтимоловый синий (0,1%-ный раствор в 20%-ном спирте) — 45,0 (0,045 г сухого)
Дистиллированная вода — 1 л
pH 6,4±

Все ингредиенты основы, кроме индикатора, растворяют при нагревании, устанавливают pH 6,4+0,1, затем добавляют бромтимоловый синий и делят среду на 4 равные части. В одну часть аминокислоты не добавляют, эта порция служит контролем. В остальные порции вносят соответственно: в первую — 1% лизина, во вторую — 1% орнитина, в третью — 1% аргинина.

Аминокислоты должны быть L-изомерами; если имеются DL-аминокислоты, то их добавляют по 2%, так как микроорганизмы активны только в отношении L-изомеров. После добавления аминокислот перед стабилизацией, в случае необходимости, реакцию среды исправляют 0,1%-ным раствором соляной кислоты. Среду разливают по 1-2,0 мл в химически чистые стерильные пробирки и стерилизуют при 105°С 20 мин. Небольшое количество флокулята в средах не имеет значения. Пептонно-дрожжевая среда имеет травянисто-зеленый цвет, при кислой реакции среда желтеет, при щелочной — синеет.

7. Среда для определения гемолитической активности вибрионов. Готовят мясопептонный бульон: мясная вода с 1% сухого пептона и 0,8% натрия хлорида. Стерилизуют при 115°С в течение 20 мин.

Постановку пробы Грейга на гемолитическую активность — см. в статье на сайте «Возбудитель холеры Vibrio cholerae».

- Читать далее "Среды для выделения и культивирования Helicobacter pylori"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 2.3.2020

Остались вопросы или замечания?

Все размещенные статьи преследуют образовательную цель и предназначены для лиц имеющих базовые знания в области медицины.
Без консультации лечащего врача нельзя применять на практике любой изложенный в статье факт.
Жалобы и возникшие вопросы просим присылать на адрес statii@dommedika.com
На этот же адрес ждем запросы на координаты авторов статей - быстро их предоставим.