а) Среда с дефибринированной кровью. Свежеприготовленную кровь добавляют в количестве 0,1-0,2 мл на 100,0 мл питательного агара. Среда непрозрачна и поэтому затрудняет изучение морфологии колоний. В связи с этим лучше пользоваться лизированной кровью, которая оставляет среду прозрачной и не мешает микроскопическому исследованию колоний.

б) Среда с лизированной кровью. Стерильную дефибринированную кровь в количестве 0,5 мл вносят в 4,5 мл стерильной дистиллированной воды и встряхивают пробирку в течение нескольких минут до полного лизиса эритроцитов. После наступления полного гемолиза лаковую кровь прибавляют в 100,0 мл расплавленного и остуженного до 45-50°С агара в количестве 1-2,0 мл, хорошо перемешивают и разливают в чашки Петри или в стерильные пробирки, скашивают агар в них и проверяют на стерильность при 37°С в течение одних суток.

Лизированную кровь можно заготавливать впрок. Для этого ее стерильно разливают по ампулам, запаивают, проверяют на стерильность при 37°С в течение 2 сут. Затем все ампулы с прозрачной кровью отбирают и хранят при 4°С. Лизированная кровь в таких условиях может сохранять свои ростовые качества до 1 года. Высушенная из замороженного состояния (лиофильная сушка) лизированная кровь сохраняется еще дольше (по В.М. Туманскому — до 5 лет).

1. Коммерческий препарат «кровь гемолизированная» (Российский НИПЧИ «Микроб») выпускается в ампулах и сохраняется при 4°С.

0,25-1,0 мл препарата вносят в 100,0 мл расплавленного и остуженного агара, хорошо перемешивают и разливают в чашки Петри.

К 10,0 мл бульона добавляют 0,05-0,1 мл (1-2 капли) крови.

Сульфит натрия (Na₂SO₃). Раствор готовят ex tempore. Навеску препарата 250,0 мг растворяют в 10,0 мл стерильной дистиллированной воды и подогревают на пламени спиртовки до кипения. 1 мл раствора добавляют к 100 мл расплавленного агара, хорошо перемешивают и разливают по чашкам Петри. К 10 мл бульона добавляют 0,1 мл (2 капли) того же раствора. Конечная концентрация сульфита — 1:400.

Сульфит натрия проверяют через каждые 2-3 мес., так как при неправильном хранении (в плохо закупоренной банке на свету) препарат окисляется до сульфата натрия, который не стимулирует рост возбудителя чумы. К агару заведомо плохого качества, дающему рост возбудителя чумы в виде единичных колоний (1-4) или при отсутствии роста при посеве 100 микробных клеток, добавляют испытуемый раствор сульфита натрия в концентрациях 1:8000, 1:4000, 1:2000, 1:1000. Контролем служит тот же агар без добавления стимулятора, а также заранее проверенный агар высокого качества. Сульфит натрия считается пригодным в той наименьшей концентрации, при которой он обеспечивает ростовые свойства диагностических сред (по чувствительности и скорости роста возбудителя чумы).

2. Сарцинный стимулятор Карпузиди (коммерческий препарат, Ростовский-на-Дону НИПЧИ). Его готовят и применяют согласно вложенному наставлению.

Витамин В1 необходимо добавлять к питательным средам при выделении тиамин-зависимых штаммов возбудителя чумы (0,0001 мг на 100,0 мл среды). Основной раствор витамина В1 готовят, добавляя 10,0 мг препарата к 10,0 мл 96%-ного этилового спирта, хранят в холодильнике, используют в течение 5-6 мес. Непосредственно перед добавлением в среды основной раствор разводят в 1000 раз (10-кратные последовательные разведения в 3 пробирках) в стерильной дистиллированной воде и в количестве 0,1 мл вносят в 100,0 мл остуженного до 50°С агара.

Хорошим стимулятором роста возбудителя чумы является гемин (1-1,25%), особенно в сочетании с глюкозой (0,05-0,1%).

Готовят раствор гемина на 0,01 N растворе едкого натра в соответствии с «Инструкцией» изготовителя и 40%-ный раствор глюкозы на дистиллированной воде. Растворы стерилизуют при 110°С в течение 30 мин. Необходимые количества стерильных препаратов вносят в расплавленный и охлажденный до 50°С питательный агар, перемешивают и разливают по чашкам Петри.

в) Ингибиторы роста банальной микрофлоры. При выделении возбудителя чумы из различных объектов для подавления роста сопутствующей банальной микрофлоры применяется краска генциан-виолет.

Генциан-виолет прекрасно подавляет рост всех представителей кокковой и споровой (патогенной и непатогенной) микрофлоры в концентрации по отношению к объему агара 1:100 000 — 1:400 000 (в зависимости от активности краски). Для полного подавления роста грамотрицательных микробов (кишечной палочки, палочки Фридлендера и особенно вульгарного протея) необходимо применение в 10 раз больших концентраций краски — от 1:10 000 до 1:40 000 соответственно. При этом следует помнить, что краска в концентрации выше 1:100 000 может задерживать на некоторое время развитие колоний возбудителя чумы.

Поэтому генциан-виолет в концентрации 1:40 000, 1:30 000, 1:20 000, 1:15 000 и 1:10 000 рекомендуется употреблять параллельно с концентрациями 1:400 000, 1:300 000, 1:200 000, 1:150 000, 1:100 000, как это указано выше и в схемах исследования на чуму различных материалов от больных и от трупов людей и животных.

1. Приготовление раствора генциан-виолета. Готовят насыщенный раствор (спиртовой) генциан-виолета: 1,0 г сухой краски заливают 10,0 мл чистого (96%) спирта и оставляют на сутки при комнатной температуре. При необходимости срочного приготовления чашек суточную выдержку при комнатной температуре можно заменить 2-3-часовой выдержкой в термостате при 37"С. Затем 1,0 мл спиртового насыщенного раствора краски прибавляют к 99,0 мл дистиллированной воды и получают спиртоводный рабочий раствор генциан-виолета (1:100). В соответствии с результатами предварительной проверки качества этой серии краски к 100,0 мл расплавленного агара прибавляют 1,0 мл рабочего раствора, получая таким образом концентрацию в агаре 1:100 000.

Для получения концентрации 1:150 000 надо к 100,0 мл агара прибавить 0,75 мл рабочего разведения краски, для концентрации 1:200 000 — 0,5 мл, 1:300 000 — 0,36 или 0,37 мл и 1:400 000 — 0,25 мл рабочего разведения генциан-виолета.

Для работы подбирают такое разведение краски, которое полностью угнетает рост кокковых и спороносных микробов и резко угнетает рост кишечной палочки и вульгарного протея. Следует подчеркнуть, что испытание ингибиторных свойств генциан-виолета необходимо проводить на агаре, к которому прибавлена оттитрованная серия сульфита натрия в количестве 1,0 мл 25%-ного раствора на 100,0 мл агара или от 2,0 до 4,5 мл лизированной крови.

г) Консерванты (для сохранения материала):

1. Консерванты Берлина и Башевой. Состав:
Масло вазелиновое — 3 весовые части
Парафин — 1 весовая часть
или
Масло вазелиновое — 3 весовые части
Вазелин белый чистый — 1 весовая часть или
Масло вазелиновое — 2 весовые части
Ланолин безводный — 1 весовая часть

Смесь подогревают до 35-45°С в зависимости от точки плавления, хорошо перемешивают и разливают в широкогорлые баночки с плотными пробками. Кусочки органов размером в 2-3 см³, костный мозг вносят в расплавленный состав, тщательно в нем размешивают и размельчают пинцетом, закупоривают пробками и взбалтывают. Материал сохраняется в течение нескольких недель и даже месяцев.

2. Консервант жидкость Брокэ. Состав:
Глицерин нейтральный — 20,0 мл
Кальций углекислый (CaCO₃) — 2,0 г
Вода дистиллированная — 80,0 мл

В емкость с 5-10,0 мл жидкости помещают кусочки органов и часть кости бедра размером в 1-2 см³. Материал сохраняется в течение нескольких дней.

- Читать далее "Среды для выделения, культивирования и идентификации холерного вибриона"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 2.3.2020