а) Агар Сабуро — основа сред для выделения и культивирования грибов.

Состав:
• питательный агар — 1000 мл,
• глюкоза 40,0 г.
• pH-5,6±0,2.
• Стерилизовать при 121°С 15 мин.

Для придания селективных свойств в среду перед стерилизацией вносят 0,05 г левомицетина сукцината (хлорамфеникола)

б) Селективная и дифференциальная среда с 2,3,5-трифенил- тетразолиумхлоридом для выделения и дифференциации видов рода Candida.

Состав:
• агар Сабуро — 1000 мл,
• 2,3,5-тетразолиум-хлорид — 0,1 г.

Приготовление:
Перед употреблением в расплавленный питательный агар Сабуро вносят навеску 2,3,5-тетразолиума хлорида, растворенную в небольшом количестве стерильной воды, перемешивают и разливают по чашкам Петри.

в) Картофельно-морковная среда с желчью (РСВ) для идентификации С. albicans на основании микроморфологических признаков.

Состав:
• очищенная от кожуры морковь (натертая на терке) — 20,0 г,
• очищенный от кожуры картофель (натертый на терке) — 20,0 г,
• агар — 25,0 г,
• свежая бычья желчь — 150 мл,
• дистиллированная вода — 1000 мл.
• pH-6,0 ± 0,2.

Приготовление:
Агар и натертые овощи помещают в колбу с водой, доводят агар до растворения при подогревании, устанавливают pH, стерилизуют при 121°С -15 минут. Перед употреблением к расплавленной и охлажденной агаровой среде добавляют свежую бычью желчь, среду разливают в чашки Петри.

г) Кукурузно-агаровая среда для идентификаци C.albicans на основании микроморфологических признаков.

Состав:
• настой кукурузной муки — 50,0 г,
• глюкоза — 2,0 г,
• агар — 15,0 г,
• вода дистиллированная — 1000 мл.
• pH-6,0 ± 0,2.

Приготовление:
Готовят настой кукурузной муки до полного ее растворения в воде. К готовому настою добавляют основные ингредиенты, устанавливают pH, стерилизуют при 121°С — 15 мин.

д) Агаровая среда (модифицированная) для теста на использование нитрата.

Состав:
• нитрат калия KNO₃ 1,6 г,
• глюкоза — 40,0 г,
• бромтимоловый синий — 0, 12 г,
• агар — 16,0 г,
• вода дистиллированная — 1000 мл.
• рН - 6,0±0,2.

Приготовление:
Ингредиенты смешивают, помещают в воду, смесь нагревают при помешивании до кипения и полного растворения. Смесь должна иметь желтый цвет. Для доведения pH до 5,9-6,0 к смеси но каплям добавляют 1 N NaOH до приобретения зеленого цвета. Реакцию среды проверяют с помощью индикаторной бумаги или другим способом. Среду разливают по флаконам, стерилизуют при 121°С в течение 15 мин. Готовую среду разливают по чашкам или пробиркам (для получения скошенного агара). Среду засевают тестируемым грибом и инкубируют не менее 7 суток при температуре 25-30°С. При отрицательной реакции цвет среды — зеленовато-желтый, при положительной — голубой.

е) Агар Диксона.

Состав:
• солодовый экстракт — 18,9 г,
• пептон — 18,0 г,
• агар — 7,25 г,
• обезвоженная бычья желчь — 10,0 г,
• твин-40 - 5 мл,
• глицерина моноолеат — 2,5 мл,
• дистиллированная вода — 500 мл.
• рН-5,6±1.

Приготовление:
Ингредиенты увлажняют частью взятой воды, а остальную часть воды нагревают до кипения и вносят в емкость с увлажнёнными ингредиентами, смешивают и стерилизуют при 12Г’С в течение 10 мин. Разливают по пробиркам или чашкам Петри.
На среде можно выращивать культуры малассезий или патологический материал, например, чешуйки кожи от пациента.

ж) Варианты солевого агара (солетолерантная среда) с различными концентрациями хлорида натрия.

Состав:
• глюкоза — 20,0 г,
• дрожжевой экстракт — 10,0 г,
• агар — 10,0 г,
• натрия хлорид (NaCl) — 110, 120 или 130 мг
• дистиллированная вода — 1000 мл
• pH 5,6±0,2.

Среду стерилизуют при 121°С в течение 15 мин., а затем разливают в чашки Петри.

з) Дифференциальная среда Штайба (для выделения Cryptococcus neoformans).

Состав:
• семена Guizotia abissinica (продаются в зоомагазинах) — 50,0 г,
• глюкоза — 1,0 г,
• креатинин — 1,0 г,
• калия дигидрофосфат КН₂PO₄ —1,0 г,
• агар — 15,0 г,
• дистиллированная вода — 1000 мл
• pH 5,5.

Приготовление:
50,0 г растертых семян Guizotia abissinica добавить к 1000 мл дистиллированной воды, кипятить в течение 30 мин и затем профильтровать через бумажный фильтр. Довести водой объем фильтрата до 1000 мл и добавить остальные ингредиенты. Автоклавировать при 110°С в течение 20 мин. Среда должна быть бесцветной и иметь pH 5,5. Для подавления бактериальной микробиоты к охлажденной среде добавить 40 ЕД/мл стрептомицина и 20 ЕД/мл пенициллина. Коричневая окраска колоний С. neoformans (в отличие от других микроорганизмов) появляется на 4-10-й день культивирования.

и) Агаризованная среда L-DOPA (для идентификации Cryptococcus neoformans).

Состав:
• L-аспарагин — 1,0 г,
• глюкоза — 1,0 г,
• КН₂РО₄ - 3,0 г,
• MgSO₃*7H₂O - 0,25 г,
• тиамин — НС1 — 1,0 г,
• биотин — 5,0 мкг,
• L-DOPA — 100,0 мг,
• агар — 20,0 г.
• дистиллированная вода — 1000 мл • pH 5,6.

Приготовление:
Добавить агар к 900 мл дистиллированной воды и автоклавировать в течение 15 мин при температуре 121"С. Растворить оставшиеся ингредиенты, кроме витаминов — тиамина-HCl и биотина, в 100 мл дистиллированной воды и довести pH до 5,6. В небольшом количестве воды приготовить раствор витаминов, простерилизовать его фильтрацией и добавить к охлажденной до 50°С агаровой среде.
На этой среде С. neoformans образует колонии от шоколадно-коричневых до черных в течение 48-72 ч.

к) Сусло-агар. Солодовое сусло профильтровать, разбавить в 2 раза водопроводной водой, разлить в пробирки или колбы и стерилизовать при 121°С 30 минут. Затем из сусла приготовить 2%-ную агаровую среду.

л) Картофельный агар для выделения и быстрой идентификации плесневых грибов.

Состав:
• обезвоженные картофельные хлопья — 20,0 г,
• глюкоза — 10,0 г,
• агар — 15,0 г,
• дистиллированная вода — 1000 мл.

Смешивают ингредиенты и доводят смесь до кипения при постоянном помешивании. Стерилизуют среду при 121°С 15 мин Разливают в чашки Петри или пробирки. Картофельные хлопья оседают на дно, но среду не нужно взбалтывать.

м) Агар Чапека-Докса.

Состав:
• глюкоза — 20,0 г,
• калий моногидрофосфат К₂НРО₄ - 1,0 г,
• нитрат натрия NaNO₃ - 3,0 г,
• хлористый калий КС1 — 0,5 г,
• MgSO₄ • 7Н₂O — 0,5 г,
• FeSO₄ - 0,015 г,
• агар — 20,0 г,
• водопроводная вода 1000 мл.

Стерилизовать в течение 30 минут при 0,5 атм.

н) Окраска калькофлуором белым.

Приготовление реактива. Растворить 0,1 г калькофлуора белого (M2R) и 0,05 Эванса голубого в 100 мл дистиллированной воды, тщательно перемешать и хранить в темной емкости при комнатной температуре.

Окрашивание: добавить 1 каплю раствора калькофлуора белого и 1 каплю 10 %-ного раствора едкого кали КОН к исследуемому образцу на предметном стекле, накрыть покровным стеклом. Просматривать в УФ-свете, используя возбуждающий фильтр К530 и барьерный фильтр В12 (или G365 возбуждающий и LP420 барьерный фильтры).

Элементы гриба флуоресцируют зеленым или голубовато-белым светом (в зависимости от сочетания фильтров) на тусклом красноватом фоне.

- Читать далее "Приготовление растворов красителей для выявления криптоспоридий"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 8.6.2020