а) Сывороточный агар для чистых культур коринебактерий. К 100,0 мл расплавленного питательного агара для коринебактерий (аминный азот 1,5 г/л), pH 7,4, охлажденному до 45°С, стерильно добавляют 10,0 мл нормальной сыворотки лошади или крупного рогатого скота, стерильной или с консервантом — хлороформом. После перемешивания среду разливают в стерильные пробирки по 3,0-5,0 мл и дают застыть в скошенном состоянии. Готовые среды хранятся в холодильнике не более двух недель.

б) Среда Пизу (для определения цистиназы у коринебактерий). При невозможности использовать сухую коммерческую среду Пизу ее можно приготовить в лаборатории самостоятельно. В качестве основы берут 1,5%-ный питательный агар, приготовленный на бульоне Мартена, среде АГВ, гидролизате казеина, рыбной муке или готовый сухой агар для определения токсигенности С. diphthenae. Реакция агаровой основы pH 7,6.

Состав:
• 1,5%-ный агар на бульоне Мартена или другой питательной основе, пригодной для дифтерийных бактерий, pH 7,6;
• 1%-ный раствор L-цистина в 0,1 N растворе H₂SO₄ или HCl;
• 0,1 N раствор NaOH;
• 10 %-ный раствор ацетата свинца, свежеприготовленный и стерилизованный дважды текучим паром;
• нормальная лошадиная или бычья сыворотка.

Приготовление. К 90,0 мл расплавленной (при 90°С) или свежесваренной питательной агаровой основы добавляют 2,0 мл 1%-ного раствора L-цистина в кислоте. Смесь перемешивают и добавляют к ней 2,0 мл 0,1 N раствора NaOH. После определения и корректировки pH до 7,6 среду стерилизуют при 112°С в течение 30 минут и хранят в холодильнике. При необходимости агаровую среду расплавляют, охлаждают до 45-50°С и стерильно добавляют к ней 1,0 мл 10 %-го раствора ацетата свинца; смесь тщательно перемешивают, добавляют к ней 9,0 мл нормальной сыворотки и разливают в стерильные агглютинационные пробирки по 2,0-3,0 мл. Хранят в холодильнике.

В качестве 0,1 N растворов кислоты и щелочи можно использовать соответствующие фиксаналы.

Среда непрозрачна, имеет желтоватый цвет (цвет питательного агара).

Посев испытуемой культуры производят уколом. Через 20-22 часа по уколу и вокруг него, на расстоянии 1,0 см от поверхности образуется темно-коричневое облачко ацетата свинца, окутывающее зону роста и свидетельствующее о расщеплении цистина. При отсутствии цистиназы потемнение среды не наблюдается.

в) Реактивы и постановка теста на уреазу по методу Заксе. Готовят два раствора: раствор мочевины в спирте (реактив А) и водный забуференный раствор индикатора фенолового красного (реактив Б).

Приготовление реактивов:

Реактив А:
• мочевина — 2,0 г,
• этиловый спирт 96° — 2,0 мл,
• вода дистиллированная — 4,0 мл,
Реактив не стерилизуют, хранят в холодильнике.

Реактив Б:
• 0,2%-ный раствор фенолового красного — 1,0 мл,
• калия фосфат однозамещенный КН₂РО₄-0,1 г,
• калия фосфат двузамещенный K₂HPO₄S Н₂O — 0,1 г,
• натрия хлорид NaCl — 0,5 г,
• вода дистиллированная — 99,0 мл.

Реактив стерилизуют однократно текучим паром 15 мин., хранят в холодильнике.

Постановка теста:

В стерильную пробирку вносят ex temporae 19 частей реактива Б и 1 часть — А; смесь разливают в узкие пробирки по 0,1 мл, по числу испытуемых культур. В каждую пробирку вносят по нескольку петель испытуемой культуры (до помутнения жидкости). Пробирки помещают в термостат на 30 мин. При положительной реакции (наличии уреазы) смесь в пробирке приобретает красный цвет. При сомнении можно оставить заткнутые пробирки на ночь и снова учесть результат.

- Читать далее "Питательные среды для выделения и культивирования микобактерий"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 8.6.2020