Фосфатазы объединяют большую группу ферментов, представляющих собой один из подклассов гидролаз, катализирующих реакции расщепления и синтеза органических соединений фосфора с участием воды. В общем виде гидролиз фосфорорганических соединений может быть представлен следующим образом:

R'R'' + НОН ↔ R'H + R''OH.

Различают специфические фосфатазы, действие которых направлено на какой-либо определенный субстрат, и неспецифические, обладающие широкой субстратной специфичностью.

Активность фосфатаз проявляется в широком диапазоне значений pH. По кислотности среды, в которой фермент проявляет наибольшую активность, фосфатазы делят на щелочные (pH 8-10) и кислые (pH 4-6).

В практике микробиологических исследований определением фосфатазной активности бактерий пользуются в целях идентификации и дифференциации родственных микроорганизмов, сходных по ряду других фенотипических признаков.

Тест основан на выявлении отщепившейся под действием фосфатазы фосфатной группы от органического субстрата, содержащего фосфат. Образовавшиеся продукты фосфатазной реакции определяются по свойственной им природной окраске или по цвету добавленного соответствующего индикатора.

Метод 1. Техника постановки теста на щелочную фосфатазу. На мясопептонный агар с натриевой солью дифосфатфенолфталеина, pH 8,2 (±0,2), высевают отдельными штрихами или бляшками суточные культуры исследуемых микроорганизмов. На одной чашке можно испытать 15-16 штаммов.

Посевы инкубируют в термостате при 37 °С в течение 24-48 ч. При отсутствии роста или слабом микробном росте время инкубации может быть увеличено до 5 сут. Просмотр посевов ведется ежедневно.

При положительном результате реакции от молекулы натриевой соли дифосфатфенолфталеина фосфатаза катализирует отщепление двух молекул фосфогрупп — гидрофосфата натрия (Na,HP04) с образованием свободного фенолфталеина, имеющего светло-розовый цвет. Кислая фосфатаза подобной реакции не дает.

При учете результатов реакции для более четкого проявления окраски фенолфталеина в колониях фосфатгюложительных микроорганизмов в крышку чашки Петри вносят 5-6 капель 25% раствора аммиака (NH₄OH) и ставят на нее перевернутую (дном кверху!) чашку с испытуемыми культурами микробов на 10 мин. Под воздействием щелочных паров аммиака розовый цвет фенолфталеина становится более интенсивным, и фосфатобразующие колонии приобретают малиновый цвет с лиловым оттенком.

Метод 2. Тест на кислую фосфатазу ставится аналогично описанному выше тесту на щелочную фосфатазу, но для его постановки используют мясопептонный агар с pH 4,5-5,5, в котором реагентом на кислую фосфатазу служит р-нитрофенилфосфат.

Учет результатов осуществляется в зависимости от результатов роста микробной культуры на 2-5-е сутки инкубации в термостате при 36(±1)°С. При положительном результате кислая фосфатаза отщепляет от р-нитрофенилфосфата группу Н₂РO₄ с выделением свободного нитробензола желтого цвета. Вокруг микробных колоний, синтезирующих кислую фосфатазу, нитробензол образует ореолы желтого цвета.

Положительный контроль: Staphylococcus aureus, S. epidermidis, Haemophylus influenzae.

Отрицательный контроль: S. saprophyticus, Micrococcus varians.

- Читать далее "Тест на декарбоксилазы аминокислот в идентификации микроорганизмов"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 3.06.2019