Тест применяется для выявления микроорганизмов, продуцирующих фермент гиппуриказу, катализирующий расщепление гиппурата натрия до образования глицина и бензойной кислоты. Результатом этого теста пользуются для дифференциальной диагностики целого ряда микроорганизмов, играющих определенную роль в патологии человека (S. agalactiae, Enterococcus spp., Campylobacter, Helicobacter идр.).

Постановка теста гидролиза гиппурата натрия может быть осуществлена двумя методами, основанными на совершенно различных принципах.

Метод 1. Тест основан на том, что бактериальная гиппуриказа катализирует гидролиз гиппурата натрия до аминокислоты глицина и бензойной кислоты. Молочное или желтоватого цвета содержимое пробирки со взвесью испытуемого микроба при добавлении индикатора нингидрина в присутствии глицина окрашивается в пурпурный цвет.

Техника постановки теста. В 0,4 мл 1% раствора гиппурата натрия, разлитого в маленькие пробирки с завинчивающимися пробками, вносят полную петлю микробной культуры, снятой с плотной питательной среды, для получения суспензии молочного цвета. Пробирки с приготовленной взвесью помещают на 2 ч в термостат при температуре 36(±1) °С. По прошествии указанного времени в содержимое пробирки вносят 0,2 мл индикатора нингидрина для обнаружения глицина. При этом пробирки повторно помещают на 10 мин в термостат.

Учет результатов. Через 10 мин, не более, учитывают результат реакции. Положительная реакция проявляется пурпурной окраской содержимого пробирок вследствие дезаминирования глицина окисляющим агентом нингидрином, который при этом восстанавливается и приобретает пурпурную окраску. Отрицательная реакция — жидкость в пробирке сохраняет белый цвет или приобретает желтоватый оттенок.

Метод 2. Тест основан на том, что при гидролизе гиппурата натрия бактерии, продуцирующие гиппуриказу, кроме аминокислоты глицина, образуют бензоат натрия, который при взаимодействии с хлоридом железа (FeCl3) превращается в бензоат железа — плотное нерастворимое соединение желто-коричневого цвета, выпадающее в осадок.

Техника постановки теста. Питательный бульон, содержащий гиппурат натрия, засевают 18-часовой культурой испытуемого микроорганизма с плотной питательной среды в количестве одной бактериальной петли диаметром 2-4 мм. Через 24-36 ч микробную культуру центрифугируют при 3000 об/мин, получая бесклеточную культуральную жидкость. Затем в 1 мл стерильного контрольного бульона, инкубированного в термостате вместе с пробирками, засеянными культурами, заведомо продуцирующими гиппуриказу, порциями но ОД мл добавляют (каждый раз встряхивая пробирку!) раствор FeCl₃.

После добавления определенного количества реактива на дне пробирок с положительным контролем появляется плотный осадок гиппурата железа, который при дальнейшем добавлении раствора хлорида железа растворяется.

Определяют общее наименьшее количество хлорида железа, приведшее к растворению осадка. После этого в отдельную стерильную пробирку отмеривают 1 мл культуральной жидкости и добавляют раствор хлорида железа в количестве, эквивалентном определенному предварительно для контроля.

Положительная реакция характеризуется образованием на дне пробирки плотного осадка бензоата железа желто-коричневого цвета. При отрицательной реакции осадка на дне пробирки нет, жидкость остается бесцветной или имеет желтоватый оттенок.

Положительный контроль: S. agalactiae.

Отрицательный контроль: S. pyogenes.

- Читать далее "Тест на бактериальные фосфатазы в идентификации микроорганизмов"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 3.06.2019