Биологический метод (биологическая проба) является самым чувствительным способом обнаружения туляремийных бактерий в любом исследуемом материале, в том числе и при исследовании материала от больных людей, так как биопробные животные (белые мыши, морские свинки) заболевают туляремией со смертельным исходом при подкожном введении единичных бактерий. Однако при обследовании больных людей даже биологический метод не всегда надежен, поскольку не в любом образце материала, взятом от больного, имеются жизнеспособные туляремийные бактерии. В отделяемом кожной язвы и в пунктате из пораженного лимфатического узла возбудитель туляремии может быть обнаружен в течение 3 нед. от начала заболевания, редко позднее. Известны случаи выделения возбудителя из мокроты, материала, взятого из зева (с миндалин) или конъюнктивы глаза. В редких случаях удается выделить возбудитель из крови, но обычно не позднее первой декады болезни.

Патологический материал (отделяемое кожной язвы, конъюнктивы глаза, миндалин или мокроту, пунктат из бубона) смешивают с небольшим количеством 0,9%-ного раствора хлорида натрия (0,3-0,5 мл) и вводят подкожно белой мыши или внутрибрюшинно морской свинке. Кровь для исследования (3-5 мл) берут из локтевой вены, разводят 1:2 гем же раствором и вводят подкожно белым мышам (по 0,5-1,0 мл) или внутрибрюшинно морским свинкам (5-7 мл). Сроки гибели биопробных животных зависят от степени инфицированности патологического материала и составляют 4-9 сут. и более (до 15) — для белых мышей и 6-15 (до 20) — для морских свинок. Культуру туляремийных бактерий от биопробных животных выделяют посевом на специальные питательные среды (см. выше). Идентификацию свежевыделенной туляремийной культуры осуществляют на основании совокупности следующих признаков:

1) морфологии клеток и грамотрицательной их окраски в мазках;

2) характера роста на желточной среде или специальных средах;

3) отсутствия роста на простых мясопептонных средах;

4) агглютинации туляремийной сывороткой;

5) специфического свечения в реакции иммунофлуоресценции;

6) способности вызывать гибель белых мышей и морских свинок при их заражении испытуемой культурой с характерными для туляремии патологоанатомическими изменениями в органах и выделением чистой культуры возбудителя.

а) Реакция имунофлуоресценции (РИФ), прямой метод. При исследовании патологического материала от больных может быть эффективен прямой иммунофлуоресцентный метод, позволяющий выявлять как живые, так и нежизнеспособные бактерии по свечению в них специфического антигена. Имеются данные, когда методом РИФ у больного туляремией через 2 мес. от начала заболевания в мазках-отпечатках из бубона были обнаружены туляремийные бактерии, тогда как выделение возбудителя бактериологическими (биологическими) методами оказалось безуспешным.

В качестве объектов для исследования в РИФ могут использоваться мазки, приготовленные из патологического материала от больного (содержимое кожного аффекта, пунктата бубона, отделяемое слизистой глаза, смывы с зева, миндалин и др.).

Для постановки РИФ (прямой метод) используют сухую люминесцирующую туляремийную сыворотку, которая представляет собой высушенную лиофильно иммуноглобулиновую фракцию сыворотки с присоединенным к ней химическим путем флуоресцирующим красителем — изотиоционатом флуоресцеина.

При исследовании в РИФ тканевого материала в целях повышения специфичности результатов анализа и для контрастирования неспецифического свечения туляремийную люминесцирующую сыворотку используют вместе с бычьим альбумином, меченным родамином, который сообщает клеткам и тканям, а также прочим органическим включениям, содержащимся в исследуемых препаратах, оранжевокрасное неспецифическое свечение различных оттенков.

Сухую люминесцирующую туляремийную сыворотку и сухой бычий альбумин растворяют в указанных на этикетках ампул объемах дистиллированной воды.

Затем, непосредственно перед нанесением на препарат, люминесцирующую туляремийную сыворотку и меченый бычий альбумин разводят раствором 0,9%-ного хлорида натрия pH 7,0-7,2, доводя их до рабочего разведения, указанного на ампуле. Далее каплю смеси туляремийной люминесцирующей сыворотки и меченного родамином бычьего сывороточного альбумина наносят на фиксированный и подсушенный препарат, равномерно распределяя смесь по всему препарату, и помещают его во влажную камеру. «Окраску» препарата производят в течение 20 мин при комнатной температуре (18-20°С), после чего препарат промывают в течение 5-10 мин проточной водопроводной водой или в нескольких сменяемых порциях раствора хлорида натрия (pH 7,2—7,4).

Затем препарат подсушивают на воздухе, наносят на него каплю разведенного глицерина (9 частей глицерина + 1 часть физиологического раствора pH 7,2-7,4) и накрывают покровным стеклом. Избыток жидкости удаляют фильтровальной бумагой. Такой препарат готов для просмотра в люминесцентном микроскопе.

В положительных случаях, т.е. когда исследуемый материал содержит туляре-мийные бактерии, в люминесцентном микроскопе обнаруживается специфическое изумрудно-зеленое свечение туляремийных бактерий.

б) Молекулярно-генетический метод. В качестве дополнительного теста диагностики туляремии у человека может быть рекомендовано обнаружение специфической ДНК в патологическом материале методом полимеразно-цепной реакции (ПЦР), выполнение которой осуществляется в соответствии с инструкцией по применению.

- Читать далее "Эпизоотологические исследования туляремии"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 30.1.2020