а) Наиболее распространенным и вместе с тем вполне точным методом серологической диагностики туляремии является реакция агглютинации (РА). Она служит для установления диагноза у больного или переболевшего (ретроспективный диагноз) и может быть использована при изучении иммунологического состояния привитых против туляремии. Обнаружение агглютининов у больного туляремией обычно отмечается через 10-15 дней, при этом агглютинационный титр сыворотки в этот период составляет 1:50-1:100, но далее быстро нарастает и на 4-6-й неделе болезни достигает 1:400-1:800, реже 1:1600 и выше.

По достижении максимальных показателей агглютинационный титр сыворотки затем медленно снижается и через 6-12 месяцев составляет 1:100-1:400, а позднее падает до 1:10-1:50 и на этом уровне может удерживаться в течение многих лет. Длительность сохранения агглютининов делает возможным использование РА для ретроспективного диагноза.

У привитых против туляремии агглютинины обнаруживаются через 2-3 нед., достигают через 4-6 нед. максимальных титров 1:160-1:320, реже выше, затем снижаются до 1:10-1:40 и обычно выявляются в течение 5-7 лет после вакцинации.

Антигеном для РА служит туляремийный диагностикум, представляющий собой убитую формалином взвесь туляремийных бактерий вакцинного штамма. В 1 мл препарата содержится 25 млрд, туляремийных бактерий. Для постановки РА туляремийный диагностикум предварительно разводят 0,9%-ным раствором хлорида натрия (pH 7,0-7,2) в 5 раз до концентрации 5 млрд, туляремийных бактерий в 1 мл.

Учет результатов РА производят через 18-24 ч невооруженным глазом. Оценку реакции осуществляют на основании степени прозрачности надосадочной жидкости в пробирках, количества и характера осадка микробной массы (агглютината).

Агглютинационный титр сыворотки учитывают по последнему разведению, которое дало вполне четкую реакцию (не менее трех плюсов).

При серологической диагностике туляремии у человека диагностическим считается титр 1:100 и выше, однако обязательно должно быть прослежено его нарастание. При отрицательной или сомнительной реакции, а также при положительной реакции в низких разведениях сыворотки у подозрительных на туляремию больных рекомендуют повторить исследование сыворотки через 7-10 дней. Нарастание титра сыворотки в 2-4 раза и выше свидетельствует о свежем случае туляремии и подтверждает диагноз.

Реакцию агглютинации можно ставить в микрообъемах, используя для этого сыворотку или плазму крови, взятую из пальца руки. Диагностикум для реакции микроагглютинации готовят из убитой культуры вакцинного штамма туляремийного микроба, которую окрашивают гематоксилином. Реакцию микроагглютинации ставят в полистироловых пластинах микротитратора Такачи. Для этого в ряд лунок полистироловой пластины микротитратора Такачи вносят 50 мкл физиологического раствора (pH 7,0-7,2).

Затем при помощи титратора с головкой объемом 50 мкл раститровывают исследуемую сыворотку, предварительно разведенную 1:5 (или неразведенную плазму крови) и добавляют в каждую лунку равный объем (50 мкл) цветного, окрашенного гематоксилином диагностикума. При этом происходит разведение сыворотки в 4 раза (с 1:5 до 1:20), и получают следующий ряд разведений сыворотки 1:20, 1:40, 1:80, 1:160 и т.д. Пластины тщательно встряхивают и помещают на 2 ч в термостат при температуре 37°С, затем выдерживают 12-18 ч при комнатной температуре. В лунках с положительным результатом антиген выпадает на дно в виде «зонтика» (агглютинат), а в случае отрицательного результата — в виде «пуговки».

Титры реакции микроаттлютинации, как правило, совпадают или на одно разведение ниже титров РА, выполненной макрометодом.

б) Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) является чувствительным методом серологической диагностики и используется как для ранней, так и ретроспективной диагностики, а также для определения иммунологического состояния привитых. У больных туляремией гемагглютинины обычно обнаруживаются в конце первой или на второй неделе заболевания. Через 1—1,5 мес. титры РНГА достигают максимальных показателей (1:10 000-1:20 000, реже выше), после чего снижаются и на уровне 1:100-1:200 сохраняются длительное время.

У привитых антитела также обнаруживаются постоянно, однако, в более низких титрах, не превышающих 1:2000-1:5000 через 1-1,5 мес. после вакцинации, и сохраняются в течение нескольких лет на низком уровне 1:20-1:80. Обычно гемагглютинационный титр сыворотки превышает таковой агглютинационный. Особенно это выражено у больных в острый период болезни или у привитых в короткие сроки после вакцинации. При ретроспективном обследовании переболевших и привитых в отдаленные сроки резких различий в титрах РА и РИГА не отмечается.

Антигеном для постановки РИГА служит туляремийный эритроцитарный диагностикум (антигенный). Препарат представляет собой формал и визированные эритроциты барана, сенсибилизированные туляремийным антигеном; выпускается в жидком и сухом виде. Жидкий препарат — 10% взвесь эритроцитов в 10%-ном растворе формалина. Сухой лиофилизированный препарат — высушенная в вакууме 10% взвесь эритроцитов без консерванта. Перед употреблением его разводят в соответствии с указаниями на этикетке. Для постановки реакции в полистироловых пластинах оба препарата применяют в 2,5%-ной концентрации, а при постановке реакции в микрообъемах — в 0,5%-ной концентрации. Гемагглютинационный титр сыворотки учитывают по последнему ее разведению, которое дало вполне четкую реакцию (не менее трех плюсов).

Диагностическим титром считается разведение 1:100 и выше, однако, так же как и в случае РА, необходимо проследить за его нарастанием.

РНГА при туляремии является достаточно специфичной и обнаруживает некоторые перекрестные реакции только с бруцеллезными сыворотками. Дифференциальная диагностика возможна по высоте титров в РНГА, которые значительно выше с гомологичным антигеном.

РНГА может быть выполнена в микрообъемах при помощи микротитратора типа Такачи, который позволяет осуществлять титрование материала в объемах 25 и 50 мкл. Техника постановки реакций, последовательность всех операций такая же, как и при исследовании в полистироловых пластинах. Следует, однако, иметь ввиду, что чувствительность микрометода обычно на одно разведение (т.е. в 2 раза) ниже, чем макрометода.

Специфичность положительного результата, полученного в РНГА, может быть проверена при помощи трехкомпонентной реакции — реакции торможения пассивной гемагглютинации (РТНГА). Эту реакцию ставят для подтверждения специфичности положительного результата РНГА, когда он вызывает сомнение или представляет особый эпидемиологический интерес. Механизм реакции заключается в специфическом торможении гемагглютинации при добавлении к испытуемой сыворотке взвеси убитых туляремийных бактерий. В реакции взаимодействуют три компонента: испытуемая сыворотка, специфический туляремийный антиген и антигенный эритроцитарный диагностикум.

в) Иммуноферментный анализ на твердом носителе используют для диагностики туляремии у больных и переболевших людей, определения наличия иммунитета у вакцинированных против туляремии. У больных туляремией специфические антитела обнаруживаются в И ФА в промежутке между 6-10-м днями, достигают максимальных показателей к 4-7-й неделе, затем уровень их снижается, но они продолжают выявляться длительное время (более 10 лет после переболевания). ИФА обеспечивает более раннюю (по сравнению с РА и РИГА) и эффективную иммунологическую диагностику. Титры антител у больных и вакцинированных колеблются в значительных пределах от 1:400 до 1:40 000 и выше и, как правило, в 10-20 раз превышают таковые в РА и РНГА.

Для постановки ИФА используют диагностическую тест-систему иммуноферментную для определения туляремийных антител. Выявление туляремийных антител в сыворотках людей происходит за счет специфического взаимодействия антигена возбудителя туляремии, адсорбированного на планшете, с туляремийными антителами в исследуемой сыворотке. Образовавшийся комплекс антиген — антитело определяют при помощи антител против иммуноглобулинов человека, меченных иероксидазой.

В соответствии с назначением тест-система представляет собой набор ингредиентов для проведения иммуноферментного анализа на твердофазном носителе и включает в себя: туляремийный липонолисахарид; антитела против иммуноглобулинов человека, меченных иероксидазой; контрольную положительную сыворотку; контрольную отрицательную сыворотку; набор солей, необходимых для приготовления буферных растворов; субстрат — О-фенилендиамин (ОФД); твин-20; бычий сывороточный альбумин (БСА); планшеты для ИФА однократного применения.

Сыворотки рекомендуется первоначально исследовать параллельно в двух лунках в разведении 1:200 с последующей раститровкой положительных, сывороток, для определения титра антител, используя двукратные разведения. Диагностическим титром в ИФА считают разведение сыворотки 1:400 и выше.

В последние годы для диагностики туляремии разработаны и некоторые другие методы, в частности основанные на использовании синтетических носителей для сенсибилизации антигена, с успехом используемые в отдельных регионах и учреждениях.

г) Непрямой иммунофлуоресцентный метод. Для обнаружения туляремийных антител готовят мазки из 1-2-суточной агаровой культуры возбудителя (взвесь 1 млрд клеток/мл). При этом на одном предметном стекле делают 8 мазков, фиксируют их в этиловом спирте в течение 30 мин, не обжигая высушивают на воздухе и помещают во влажную камеру. Исследуемую сыворотку разводят двукратно до разведений от 1:10 до 1:640-1:1280 и наносят пастеровской пипеткой на мазки, начиная с большего разведения. Влажную камеру с препаратом помещают в термостат при 37°С на 30 мин. Мазок отмывают от несвязавшихся антител и после подсыхания его вновь помещают во влажную камеру, докрашивая антивидовой люминесцирующей сывороткой в рабочем разведении. После просмотра препарата устанавливают титр антител в исследуемой сыворотке.

Контролем служат препараты, в которых туляремийные бактерии обработаны туляремийной сывороткой (положительный контроль) и сывороткой, не содержащей антитела к возбудителю туляремии (отрицательный контроль). При исследовании сыворотки больного с подозрением на туляремию диагностическим считается титр не менее 1:40.

- Читать далее "Бактериологический метод диагностики туляремии"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 30.1.2020