Возникновение заболеваний среди людей определяется эпизоотическим состоянием очагов. Разлитые эпизоотии туляремии наблюдаются обычно в годы высокой численности мелких млекопитающих (ММ). Повышение численности ММ является важной характеристикой состояния очага и признаком возможного неблагополучия.

В поисках туляремийных эпизоотий лабораторному исследованию подвергают отловленных разными методами диких ММ или их трупы, собранные в природе, подснежные гнезда грызунов, продукты жизнедеятельности ММ, погадки птиц (ПП), помет хищных млекопитающих (ПXM), а также солому, мякину, талую воду и другие объекты, воду из естественных водоемов и колодцев, гидробионтов и др. Среди членистоногих переносчиков основное внимание уделяют иксодовым клещам. Кроме того, исследуют мелких эктопаразитов, собранных с ММ. При трансмиссивных вспышках исследуют кровососущих двукрылых (комаров, слепней и др.). Серологические исследования домашних животных проводят при соответствующих эпизоотологических и эпидемиологических показаниях.

В практике эпизоотологического исследования на туляремию основное место принадлежит бактериологическим методам, обеспечивающим выявление и выделение возбудителя туляремии. Вместе с тем существенную роль приобретают серологические методы, позволяющие с меньшими трудозатратами и в короткий срок дать заключение об эпизоотологическом состоянии территории. В последнее время разработан и находит применение высокочувствительный метод ПЦР, позволяющий по обнаружению специфической ДНК судить о наличии возбудителя туляремии в пробе и выявлять «некультивируемые» формы микроорганизма.

а) Бактериоскопия. Ввиду мелких размеров туляремийный микроб может быть достоверно обнаружен в окрашенных мазках-отпечатках только из обильно обсемененного патологического материала. Четко положительные результаты получают при содержании в 1 г ткани более 1 млрд, микробов. Поэтому бактериоскопия эффективна при исследовании павших диких или биопробных животных, но обычно безуспешна при исследовании зверьков на ранних стадиях заболевания. Метод не используется при исследовании воды, смывов с объектов внешней среды, где концентрация возбудителя может быть незначительной.

б) Люминесцентная микроскопия (РИФ) является эффективным методом обнаружения как живых, так и погибших бактерий туляремии при концентрации 1 млн. микробных клеток в 1 мл. При меньших концентрациях — 100 тыс., 10 тыс., 1 тыс. микробных клеток в 1 мл возбудитель может быть обнаружен, но его выявление не носит закономерного характера. Объектами исследования могут быть бактериальные взвеси, отпечатки и гомогенаты органов и тканей животных, беспозвоночные переносчики. Метод прост и не имеет себе равного по быстроте получаемого ответа (1,5-2 ч), поэтому рекомендуется для ускоренного выявления и идентификации возбудителя туляремии.

Все процедуры постановки реакции и учета ее результатов проводят в соответствии с инструкцией по применению иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих туляремийных сухих.

в) Бактериологический метод. Посев на питательные среды применяют для выделения культуры возбудителя туляремии из органов павших или забитых диких животных, павших или убитых лабораторных животных, а также зверьков, у которых обнаружены патологоанатомические изменения, характерные для туляремии. Иксодовых клещей, воду, почву, смывы с объектов внешней среды не исследуют посевом ввиду их контаминации посторонней микрофлорой. Для бактериологического исследования применяют специальные питательные среды для культивирования туляремийного микроба, подробное описание которых изложено выше.

г) Биологический метод является самым эффективным; он применяется для обнаружения туляремийных бактерий в любом исследуемом материале. Биологическим методом можно исследовать органы павших или убитых диких млекопитающих, кровососущих членистоногих, гидробионтов, воду, смывы с различных субстратов, т.е. материалы, в которых могут содержаться живые туляремийные бактерии. Для биологической пробы обычно используют беспородных белых мышей, которые заболевают и гибнут от туляремии при подкожном введении суспензии, содержащей единичные бактерии. При массивном инфицировании исследуемых объектов животные погибают уже на 3-4-е сутки, при меньшей обсемененности материала гибель мышей может затянуться до 7-9 сут., иногда до 15-20.

В большинстве случаев у погибших животных обнаруживаются характерные для туляремии патологоанатомические изменения: воспаление ткани на месте заражения (плотный инфильтрат), увеличение, уплотнение и гиперемия лимфатических узлов, особенно близлежащих к месту введения, резкая гиперемия сосудов подкожной клетчатки, уплотнение и увеличение селезенки, печени, увеличение и гиперемия надпочечников, гиперемия тонкого кишечника. В мазкахотпечатках из селезенки, печени и крови при окраске по Романовскому-Гимзе или путем люминесцентной микроскопии обнаруживают большое количество туляремийных бактерий, а в посеве на специальные питательные среды селезенки и печени уже через 18-24 ч появляется рост культуры возбудителя. Для биологической пробы могут быть использованы и морские свинки, обладающие такой же высокой чувствительностью к туляремии, как и белые мыши, а также дикие грызуны первой группы (обыкновенные полевки, домовые мыши), отловленные на неэпизоотичных территориях и выдержанные в карантине 30 сут.

Биопробных животных выдерживают следующие сроки: белых мышей — до 15-20 сут., морских свинок — до 25 сут.

д) Серологические методы исследования в ряде случаев являются основным методическим приемом, позволяющим выявить туляремийные эпизоотии благодаря возможности исследовать материал, не пригодный для бактериологического исследования. Серологические методы эффективны при поисках антигена в трупах грызунов, ПП, ПХМ, субстратах гнезд и других объектах внешней среды.

При исследовании трупов диких или лабораторных животных готовят суспензию из кусочков органов животных (селезенка, печень) путем растирания с добавлением 0,9% раствора натрия хлорида из расчета 1:5 или 1:10. Полученную суспензию обеззараживают, фильтруют для получения относительно прозрачного фильтрата. При исследовании субстрата гнезда грызунов следует брать его целиком вместе с прилегающими слоями почвы. Материал заливают 0,9%-ным раствором натрия хлорида (примерно 10 мл), выдерживают 1-6 ч; надосадочную жидкость обеззараживают, фильтруют, после чего используют в серологических реакциях. Для серологического исследования бактериальной культуры последнюю выращивают 2 сут. при 37°С на желточной или агаровой среде, готовят взвесь на 0,9%-ном растворе натрия хлорида (pH 7,0-7,2) с концентрацией 1x10я микробных клеток в 1 мл, обеззараживают, разводят в 10 раз до концентрации 100 млн. микробных клеток в 1 мл и используют в серологических реакциях.

Наиболее эффективной и специфичной серологической реакцией для выявления туляремийного антигена при исследовании органов животных, ПП, ПХМ, субстрата гнезд, почвы и т.п. является реакция нейтрализации антител (РНАт) с туляремийным антигенным эритроцитарным диагностикумом. При массовых исследованиях различных объектов внешней среды за диагностический титр принимают разведение фильтрата 1:20 и выше. Результаты в более низких титрах расценивают как сомнительные. При анализе некоторых объектов (бактериальные суспензии, органы животных и др.) помимо РНАт можно применять иммуноферментный анализ (ИФА), реакцию объемной агломерации (РОА), реакцию коагглютинации (РК) и некоторые другие тесты, используемые в отдельных регионах и учреждениях.

ИФА используют для выявления туляремийного антигена в органах животных, ПП, ПХМ, других объектах внешней среды, а также для идентификации изолированных культур возбудителя туляремии. Метод отличается высокой чувствительностью, специфичностью, возможностью количественной и автоматизированной оценки результатов, воспроизводимостью и стандартностью основных ингредиентов анализа. При помощи ИФА можно обнаружить 10³-10⁴ туляремийных бактерий в 1 мл или 1-5 нг/мл антигена. Для постановки ИФА используют диагностическую иммуноферментную тест-систему для определения туляремийного антигена.

Для выявления антител у животных наиболее эффективными методами являются реакция агглютинации (РА) и реакция непрямой гемагглютинации (РИГА). Используют сыворотку, плазму крови животных или смывы из грудной полости. Титры антител у переболевших диких животных колеблются в пределах 1:10-1:320, редко выше, в зависимости от давности переболевания. У сельскохозяйственных животных они могут достигать 1:320 — 1:640, но чаще бывают низкими. Выявление антител у животных указывает на их контакт с возбудителем и наличие эпизоотии туляремии.

е) Исследование методом ПЦР. В ряде случаев для определения ДНК возбудителя туляремии в различных объектах используют ПЦР. Метод превышает по чувствительности серологические тесты и применяется для индикации и ускоренной диагностики туляремии. Подготовку материала и проведение анализа осуществляют в соответствии с инструкцией по применению тест-системы ПЦР для выявления ДНК возбудителя туляремии.

ж) Идентификация возбудителя туляремии. Идентификацию возбудителя осуществляют на основании совокупности признаков, описанных в отдельных статьях на сайте.

Выделенная культура должна иметь характерный для микроба туляремии рост на свернутой желточной среде в виде извилистого слегка блестящего (не сухого) почти бесцветного налета не сильно выраженной слизистой консистенции, хорошо снимающегося петлей. Культура легко суспендируется. Для изучения морфологии и тинкториальных свойств готовят мазок на предметном стекле, который фиксируют и окрашивают по Граму. В мазке туляремийный микроб представляет собой мелкую грамотрицательную коккобактерию. В окрашенных мазках из культуры с плотной среды обнаруживается обильная слизь. Присутствие в мазке окрашенной слизи характерно для возбудителя туляремии. Для проверки отсутствия роста на простых питательных средах используют слабощелочные питательные агар и бульон.

Антигенную специфичность изолированной культуры проверяют при помощи реакции агглютинации с лошадиной (коммерческой) иммунной сывороткой. Для этого испытуемую культуру выращивают в течение 2 сут. при 37°С на свернутой желточной среде в количестве 2 -3 пробирок. Чистоту посева контролируют бактериоскопией. Реакцию агглютинации ставят обычным способом в пробирках. В качестве антигена используют живую испытуемую культуру, суспендированную в 0,9%-ном растворе натрия хлорида (pH 7,0-7,2) до концентрации 1х10⁹ микробных клеток в 1 мл по оптическому стандарту мутности 10 единиц ГИСК им. Л.А.Тарасевича. После добавления антигена к разведениям сыворотки пробирки выдерживают 2 ч при 37°С, затем 12-18 ч при комнатной температуре, после чего проводят учет результатов. Культура должна агглютинироваться до разведения сыворотки, указанного в инструкции по применению препарата.

При этом должна иметь место четкая реакция, сопровождающаяся полным просветлением жидкости и выпадением на дно пробирки плотного агглютината. При встряхивании пробирки агглютинат разбивается на крупные хлопья, а жидкость остается прозрачной. Специфичность выделенной культуры может быть подтверждена также при помощи РИФ. При обработке культуры туляремийной люминесцирующей сывороткой обнаруживают специфическое яркое зелено-желтое свечение бактерий.

При возможности проводят проверку вирулентности культуры, но не позднее месячного срока после изоляции. Ориентировочное определение вирулентности проводят, как правило, на одном из двух видов животных (белые мыши или морские свинки). Для заражения используют 2 дозы — 1 и 10 микробных клеток по 2-3 животных на каждую. Свежевыделенные туляремийные культуры при подкожном введении вызывают гибель животных с обнаружением характерных для туляремии изменений в органах и выделением чистой культуры.

На территории Российской Федерации циркулируют и выделяются культуры голарктического подвида возбудителя туляремии — F.tularensis subspecies holarctica, различающиеся по чувствительности к эритромицину (и другим макролидам). Для определения этого свойства используют диски с эритромицином, содержащие 15 мкг антибиотика. Эта концентрация позволяет дифференцировать штаммы туля-ремийного микроба на два биологических варианта — биовар 1 Ery^s и биовар 11 Ery^r. Для определения принадлежности к тому или другому биовару готовят суспензию испытуемой культуры в концентрации 1х10⁹ микробных клеток в 1 мл по оптическому стандарту мутности 10 единиц ГИСК им. Л.А.Тарасевича. Суспензию культуры в объеме 0,5 мл вносят в чашку с агаровой средой, равномерно распределяя ее по поверхности, после чего накладывают в центральную часть чашки диск с эритромицином. Чашку помещают в термостат при 37°С. Учет и оценку результатов проводят через 1-2 сут.

Чувствительная к эритромицину культура образует вокруг диска выраженную зону задержки роста диаметром 2-3 см; резистентная к эритромицину культура дает равномерный рост по всей поверхности чашки.

- Читать далее "Лечение и профилактика туляремии"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 30.1.2020