Техника постановки ПЦР: учет продуктов амплификации методом электрофореза в агарозном геле

После проведения ПЦР осуществляют электрофорез в агарозном геле. Образцы, содержащие синтезированные в ПЦР фрагменты ДНК, наносят в лунки агарозного геля. Под действием электрического поля фрагменты ДНК, несущие отрицательный заряд, движутся от отрицательного полюса к положительному. При этом скорость фрагментов различной величины в агарозном геле разная: за одно и то же время короткие фрагменты проходят большее расстояние от старта, чем длинные. После просматривания геля в ультрафиолетовом свете можно говорить о результатах ПЦР (в случае успешного прохождения реакции на геле видны светящиеся полоски).

Продукт ПЦР, где в качестве матрицы использовалась нуклеиновая кислота, выделенная из исследуемого образца, сравнивается с продуктом реакции, где в качестве матрицы использовалась контрольная ДНК, — так называемый положительный, или (+)-контроль.

Пробы, в которых положение полученной полосы точно совпадает с положением полосы (+)-контроля, считаются положительными.

Помимо реакции с исследуемыми образцами и (+)-контролем должна быть поставлена еще одна проверочная реакция — реакция отрицательного контроля — (-)-контроля. В ней вместо матрицы используется вода. Эта реакция проводится, чтобы убедиться, что используемые реактивы не заражены амплификатами или ДНК. Если (-)-контроль срабатывает как (+)-конгроль, это свидетельствует о контаминации реактивов и требует повторного анализа с использованием новых реагентов.

а) Электрофорез в агарозном геле, содержащем бромистый этидий:

1. Приготовление буфера для электрофореза. Для приготовления 1 л однократного буфера для электрофореза к 20 мл 50-кратного ТАЕ-буфера добавляют 980 мл дистиллированной воды и 25 мкл раствора бромистого этидия (10 мг/мл).

ТАЕ-буфер можно приготовить самостоятельно по следующей прописи: навеску 4,04 г триса растворяют в 200 мл дистиллированной воды, добавляют 1,14 мл ледяной уксусной кислоты и 2 мл 0,5М раствора ЭДТА, pH 8,0, и доводят объем буфера до 1000 мл дистиллированной водой. После растворения компонентов буфера добавляют 25 мкл раствора бромистого этидия (10 мг/мл).

2. Приготовление агарозного геля. К 100 мл однократного буфера для электрофореза добавляют 2 г агарозы, доводят до кипения и охлаждают до 45 °С. Заливают в специальную форму с гребенкой и дают затвердеть. Гребенку осторожно вынимают, форму с агарозой переносят в аппарат для горизонтального электрофореза и погружают в буфер.

3. Электрофорез продуктов амплификации. К 7 мкл амплификационной смеси (водной фазы) добавляют 1,5 мкл буфера для нанесения образца, перемешивают нипетированием и полученный образец вносят в лунки агарозного геля, образовавшиеся от зубцов гребенки.

Электрофорез проводят при напряжении 6-8В/см длины геля в течение 60 мин. За это время краситель успевает пройти не менее половины геля. Направление движения образцов в геле — от — к +!

4. Учет результатов электрофореза. Результаты электрофореза просматривают в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм на приборе УФ «Трансиллюминатор». Результаты реакции проявляются в виде светящихся красноватых полос. Полученные результаты документируют фотографированием гелей. Фотография может быть сделана любым фотоаппаратом с оранжевым светофильтром.

Пример агарозного геля, полученный после амплификации образцов
Пример агарозного геля, полученный после амплификации образцов

б) Интерпретация результатов ПЦР. Результат ПЦР можно интерпретировать как положительный или отрицательный в зависимости от того, обнаружена в образце искомая последовательность или нет.

Пример агарозного геля можно подробно рассмотреть на рисунке выше. На первую «дорожку» геля нанесен амплификат, который получился в пробе с положительным контролем. На последнюю «дорожку» нанесен образец отрицательного контроля, или контроля чистоты реагентов. На «дорожках» 2-6 приведен анализ пяти экспериментальных образцов. Первые два образца («дорожки» 2 и 3) — положительные. Остальные три («дорожки» 4 и 5) — отрицательные.

В некоторых случаях амплификации вообще не происходит, и очень трудно понять, по какой причине. В биологических образцах могут содержаться различные вещества, которые ингибируют полимеразную реакцию. Если по этой причине ПЦР не прошла в какой-то отдельной пробирке, то результат, полученный в образце, называют ложноотрицательным. Для того чтобы понять, каков результат, отрицательный или ложноотрицательный, в некоторых тест-системах вводят внутренний контроль реакции. Внутренний контроль (добавление известной последовательности ДНК в реакционную смесь) дает заведомо положительный результат ПЦР.

При этом в случае положительного результата ПЦР и в положительном контроле на геле видны две полосы (специфическая полоса и полоса внутреннего контроля), в случае отрицательного результата видна одна полоса внутреннего контроля и в случае ложноотрицательного результата на геле не будет видно ни одной полосы.

- Читать далее "Преимущества (плюсы) ПЦР"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 28.08.2019

Остались вопросы или замечания?

Все размещенные статьи преследуют образовательную цель и предназначены для лиц имеющих базовые знания в области медицины.
Без консультации лечащего врача нельзя применять на практике любой изложенный в статье факт.
Жалобы и возникшие вопросы просим присылать на адрес statii@dommedika.com
На этот же адрес ждем запросы на координаты авторов статей - быстро их предоставим.