Техника выделения РНК для ПЦР

Отличительная особенность молекул РНК — их нестабильность, в отличие от молекул ДНК. Причиной этого прежде всего является то, что РНК может подвергаться щелочному гидролизу в среде, имеющей высокие значения pH. Кроме того, в клетках, в растворах, даже в бидистиллированной воде могут находиться РНКазы — ферменты, разрушающие РНК. Это очень стабильные ферменты; их можно разрушить нагреванием раствора в течение 4 ч при температуре 180 °С или химическими ингибиторами. Самым распространенным ингибитором, который действует на основной спектр РНКаз, является диэтилпирокарбонат (ДЕПК).

Описание выделения полиаденилированной РНК подробно не имеет смысла, так как существует множество коммерческих наборов, в которых отработаны условия выделения РНК за poly (А)-участок на З’-конце. Принцип таких наборов следующий: в буферах с высокой ионной силой poly (А)-хвост полиаденилированной РНК образует комплекс с oligo (dT), ковалентно связанным с твердой матрицей (например, с целлюлозой). Это позволяет выделять мРНК из сложной популяции клеточных РНК. Если нанести на колонку с oligo (dТ)-целлюлозой суммарную клеточную PHК в буфере с высокой ионной силой, то на колонке задержится только poly (А)-РНК, которую можно затем элюировать буфером с низкой ионной силой или водой и сконцентрировать методом переосаждения этанолом.

а) Выделение РНК при помощи гуанидинизотиоцианата. Метод дает хорошие результаты при работе с образцами, содержащими большие количества РНКаз, и, по-видимому, является наиболее распространенным методом выделения РНК. Гуанидинтиоцианат — очень сильный денатурирующий агент, который используется для одновременного лизиса клеток и денатурации всех клеточных белков (в том числе РНКаз).

1. К образцу культуры (1х106 клеток) или образцу клинического материала (0,2 мл) добавляют лизирующий раствор, содержащий 4М гуанидинизотиоцианат, 25 мМ цитрат натрия, pH 7,0, 0,5% саркозил, 0,1 М (1-меркаптоэтанол. Содержимое пробирки перемешивают на смесителе типа «Vortex».

2. Последовательно добавляют 0,1 мл 2М ацетата натрия, pH 4,0, 1 мл фенола, насыщенного водой, и 0,1 мл смеси хлороформ — изоамиловый спирт в соотношении 49:1. После добавления каждого реагента смесь интенсивно перемешивают.

3. Перемешивают все реагенты в смесителе типа «Vortex» в течение 10 мин. Инкубируют 15 мин на льду.

4. Смесь центрифугируют при 10-13 000 об/мин в течение 15 мин при 4°С.

5. Водную фазу переносят в чистую пробирку и добавляют равный объем изопропанола. Инкубируют в течение 60 мин при -20 °С для осаждения РНК.

6. Центрифугируют в течение 20 мин при 10 000 об/мин.

7. Осадок РНК промывают 75% этанолом и сушат на воздухе или под вакуумом в течение 10-15 мин. Осадок растворяют в воде, обработанной ДЕПК.

б) Выделение РНК с использованием неорганического носителя:

1. Образцы исследуемого биологического материала (в объеме до 0,2 мл) помещают в полипропиленовые пробирки объемом 1,5 мл, добавляют высокосолевой раствор, содержащий 6М гуанаданизотиоционата, и инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре.

2. Центрифугируют при высоких оборотах (13 000 об/мин) в течение 10 мин. После центрифугирования надосадочную жидкость переносят в чистые пробирки, а осадок отбрасывают.

3. К полученному супернатанту добавляют 40 мкл сорбента. Инкубируют 10 мин при комнатной температуре, периодически перемешивая в смесителе типа «Vortex».

4. Затем центрифугируют 15 с на микроцентрифуге при 13 000 об/мин. Надосадочную жидкость отбрасывают.

5. К осадку добавляют 0,1 мл раствора для промывки, перемешивают в смесителе типа «Vortex» и осаждают сорбент центрифугированием в течение 15 с. Надосадочную жидкость отбрасывают. Промывка сорбента проводится для удаления не связавшихся с сорбентом частиц. Процедуру промывки повторяют 2 раза.

6. К осадку добавляют 0,1 мл раствора для второй промывки, перемешивают в смесителе типа «Vortex» и осаждают сорбент центрифугированием в течение 15 с. Надосадочную жидкость отбрасывают. Процедуру повторяют 2 раза.

7. Осадок подсушивают в течение 10 мин при 56 °С в пробирке с открытой крышкой.

8. К осадку добавляют 30 мкл деионизованной воды, перемешивают и инкубируют в течение 10 мин при 56 °С в закрытых пробирках. Центрифугируют в течение 30 с при 13 000 об/мин. Отобранную надосадочную жидкость переносят в чистые пробирки и используют для проведения ПЦР.

- Читать далее "Техника постановки ПЦР: проведение собственно ПЦР"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 28.08.2019

Остались вопросы или замечания?

Все размещенные статьи преследуют образовательную цель и предназначены для лиц имеющих базовые знания в области медицины.
Без консультации лечащего врача нельзя применять на практике любой изложенный в статье факт.
Жалобы и возникшие вопросы просим присылать на адрес statii@dommedika.com
На этот же адрес ждем запросы на координаты авторов статей - быстро их предоставим.