Реакционная смесь для ПЦР состоит из следующих компонентов, которые обязательно должны быть добавлены в пробирку:

1) термостабильного фермента ДНК-полимеразы;

2) двух олигонуклеотидных праймеров (обычно 20 нуклеотидов длиной), подобранных на специфический участок ДНК, который необходимо копировать;

3) четырех дезоксирибонуклеотидов (dNTPs);

4) ДНК или РНК, выделенной из клинического образца;

5) набора солей определенной кислотности (буферная система), в которой ДНК-полимераза эффективно работает, обязательно содержащего ионы Mg²⁺.

Как показали исследования, состав реакционной смеси нужно подбирать в каждом конкретном случае. Ионный состав и pH реакционного буфера необходимо подбирать так, чтобы активность термостабильной ДНК-полимеразы, используемой в реакции, была максимальной. Значение pH для различных термостабильных ДНК-полимераз должно быть в пределах 8,2-8,9, значение ионной силы — 0,01-0,08. Эффективность ПЦР зависит от концентрации dNTPs в реакционной смеси. Обычно концентрация каждого dNTP составляет 0,04 — 0,25 мМ. Увеличение концентрации dNTP до 1 — 1,2 мМ снижает активность фермента на 30%. Концентрация ионов Mg²⁺ оказывает существенное влияние на активность термостабильных ДНК-полимераз.

Наличие в ДНК-матрице примесей хелатирующих агентов может привести к снижению концентрации свободных ионов Mg2+ и тем самым к снижению эффективности ПЦР. При суммарной концентрации dNTPs 0,7 — 0,8 мМ оптимальная концентрация этих ионов — 1,5-2 мМ; повышение концентрации ионов Mg²⁺ до 10 мМ снижает активность Taq ДНК-полимеразы на 50%. Необходимо отметить, что при проведении реакции обратной транскрипции можно использовать в качестве двухвалентного иона как Mg²⁺, так и Мn²⁺. Специфичность и эффективность ПЦР и ОТ/ПЦР зависит от концентрации праймеров. Обычно концентрация праймеров составляет 0,3—1 мкМ. Было показано, что высокая концентрация праймера может приводить к образованию праймерных димеров. В результате этого на отдельных праймерсвязывающих участках, расположенных в непосредственной близости, возникают ложные неспецифические ампликоны (артефакты). Для снижения эффективности образования дуплекса праймеров последние подбирают таким образом, чтобы в районе их 3’-концов не было комплементарных взаимодействий.

Для повышения специфичности связывания праймера с матрицей некоторые исследователи рекомендуют использовать 10% диметилсульфоксид (DMSO). Влияние DMSO и других неионных реагентов, по-видимому, объясняется тем, что они, действуя на вторичную структуру матрицы, уменьшают число мест неспецифической посадки праймера. Однако высокие концентрации DMSO (больше 10%) могут снижать активность Taq ДНК-полимеразы почти на 50%. Для повышения эффективности гибридизации ДНК (РНК) и праймера можно использовать тетраметиламмо-нийхлорид (ТМАК). Использование ТМАК позволяет практически полностью избежать неспецифического праймирования, при этом ингибирования ДНК-полимеразы не наблюдается.

- Читать далее "Требования предъявляемые для ПЦР-лаборатории и необходимое оборудование"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 28.08.2019