Для проведения анализа при помощи ПЦР необходимо правильно отобрать клинические образцы, затем выделить нуклеиновые кислоты (ДНК или РНК, в зависимости от определяемого возбудителя). Следующим шагом является проведение ПЦР или ОТ/ПЦР. Последний шаг диагностики — детекция результата ПЦР методом электрофореза в агарозном геле, содержащем бромистый этидий.

На всех стадиях постановки ПЦР необходимо использовать перчатки, меняя их после каждого этапа реакции. Каждый этап постановки ПЦР подлежит лабораторному контролю. Перекрестные контаминации от пробы к пробе и контаминация «положительными контролями» предотвращаются разделением стадий выделения, проведения ПЦР и электрофореза. Кроме того, важным условием является аккуратность в работе с исследуемыми образцами. Необходимо также регулярно обрабатывать поверхности 0,3% раствором соляной кислоты. Для работы необходимо использовать одноразовые пластиковые пробирки и наконечники для пипеток. Контаминация продуктами амплификации также может быть предотвращена наличием отдельного помещения для проведения электрофореза.

Кроме того, рекомендуется использовать различные методы инактивации продуктов ПЦР (фотохимические, химические), однако на практике они используются редко. Наиболее часто прибегают к энзиматической инактивации продуктов ПЦР с использованием урацил-N-гликозилазы. В реакционную смесь добавляют дезоксиурацилтрифосфат (dUTP) вместо дезокситимидинтрифосфата (dTTP). Следовательно, все продукты ПЦР (ампликоны) содержат остатки дезоксиурацила. Урацил-N-гликозилаза, которую добавляют в реакционную смесь, удаляет остатки урацила в ампликонах-контаминангах до начала ПЦР. После нагревания смеси до 94°С фермент инактивируется, и гидролиза амплификатов, полученных в процессе ПЦР, не происходит. Такую инактивацию применяют в некоторых коммерческих тест-системах.

В настоящее время для определения различных инфекционных агентов разработаны тест-системы, в которые входят набор для выделения нуклеиновых кислот, набор для проведения ПЦР и набор для проведения электрофореза в агарозном геле. При использовании коммерческой тест-системы необходимо строго следовать приложенной инструкции по ее применению. Мы приводим некоторые методики, которые можно использовать самостоятельно для постановки ПЦР в лабораторных условиях.

Рассмотрим все этапы лабораторной диагностики при помощи ПЦР.

Важным этапом является взятие клинического материала для анализа. Пробы могут быть различными в зависимости от заболевания. Обязательное требование для отбора проб — наличие одноразового инструмента для каждой пробы. Если нет одноразового инструмента, то после каждого отбора пробы необходимо прожечь или прокипятить инструмент. При несоблюдении данного условия отрицательные пробы можно заразить (контаминировать) и получить ложноположительный результат. Каждую пробу необходимо поместить в отдельную пробирку с номером или другой маркировкой. Образцы крови, спермы используют для анализа без дополнительной подготовки. Биопсийный материал измельчают или гомогенизируют в физиологическом растворе.

Образцы фекалий суспендируют в фосфатном буфере, затем центрифугируют при 10 000 об/мин в течение 10 мин при 4°С, для выделения нуклеиновых кислот используют супернатант. Образцы мочи (10 мл) центрифугируют при 5000 об/мин в течение 10 мин, надосадочную жидкость осторожно отбирают и отбрасывают так, чтобы над осадком осталось примерно 0,2 мл жидкости, суспензию дополнительно центрифугируют в настольной центрифуге при 13 000 об/мин 3 мин. Надосадочную жидкость отбрасывают, осадок используют для выделения нуклеиновых кислот. Фарингеальные смывы (5—10 мл) центрифугируют при 5000 об/мин в течение 10 мин, надосадочную жидкость осторожно отбирают и отбрасывают так, чтобы над осадком осталось примерно 0,2 мл жидкости, которую используют для выделения нуклеиновых кислот.

- Читать далее "Техника постановки ПЦР: выделение нуклеиновых кислот (ДНК или РНК)"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 28.08.2019