Для проведения реакции необходимо подготовить пробирки для ПЦР. Они обычно меньше пробирок для выделения нуклеиновых кислот, их объем 0,25-0,5 мл. Пробирки маркируют так же, как и пробирки для выделения нуклеиновых кислот. Обычно диагностические анализы проводят в объеме 25 мкл.

Общую реакционную смесь для ПЦР на N образцов с учетом контролей готовят по следующей схеме:

Реактивы смешивают в последовательности, в которой они перечислены в таблице. В последнюю очередь добавляют фермент Taq-полимеразу. ОТ/ПЦР можно проводить в две стадии в двух пробирках. Однако более технологично проводить ее две стадии в одной пробирке. Поэтому при выполнении ОТ/ПЦР в реакционную смесь необходимо добавить 0,125 мкл ревертазы MMLV-RT, уменьшив количество воды на величину объема добавленного фермента. Смесь перемешивают и разливают по 20 мкл в предварительно промаркированные пробирки для ПЦР. В каждую пробирку вносят по 5 мкл исследуемой ДНК или РНК и осторожно, не касаясь стенок пробирок, наносят по 2-3 капли масла (примерно 40 мкл).

Если произошло смешивание фаз, пробы центрифугируют несколько секунд (для разделения водной и масляной фаз), затем пробы помещают в амплификатор.

Амплификатор, как уже говорилось ранее, — это прибор для проведения ПЦР. Он представляет собой программируемый термостат, в котором происходит последовательное нагревание и охлаждение проб согласно заданной программе.

В настоящее время используется несколько типов амплификаторов. Самые современные приборы (с активным регулированием) позволяют существенно сокращать время проведения реакции. Кроме того, выпускаются приборы, снабженные прогреваемыми крышками. При составлении программы амплификатора следует придерживаться следующих рекомендаций. Обычно для денатурации достаточно 15-30 с (в зависимости от используемых пробирок и амплификатора). Время денатурации 30 с универсально — достаточно для любого амплификатора. В амплификаторах с активным регулированием оно короче, чем в приборах классического типа и может составлять 5-10 с.

Для повышения эффективности амплификации используют предварительную денатурацию. Для наиболее эффективного расхождения цепей ДНК необходимо в первом цикле увеличить время денатурации до 3-5 мин. Это снимает ингибирующий эффект низкомолекулярных и белковых примесей. Температуру отжига праймеров следует подбирать опытным путем, используя положительные и отрицательные контроли и соответствующую формулу (приведена выше). Время, необходимое для гибридизации праймеров, различно для разных тест-систем. При использовании амплификатора с активным регулированием достаточно нескольких секунд. Универсальное для всех типов амплификаторов время отжига праймера — 20-30 с. Теоретически полимеризация проходит достаточно быстро, но на практике время полимеризации зависит от типа амплификатора и от размера продукта ПЦР-фрагмента. Считается, что копирование каждых 1000 пар нуклеотидов занимает 1 мин.

Таким образом, для эффективного синтеза фрагмента длиной 500 нуклеотидов достаточно 30 с. При работе с амплификатором с активным регулированием для успешной элонгации достаточно 10-20 с. В различных постановках ПЦР время элонгации подбирается экспериментально. В последнем цикле рекомендуется увеличить время элонгации до 5-7 мин для эффективного «достраивания» полученных амплификатов. Число циклов — 30-35 для стандартной ПЦР и но 20-25 — для каждой стадии гнездовой ПЦР.

- Читать далее "Техника постановки ПЦР: учет продуктов амплификации методом электрофореза в агарозном геле"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 28.08.2019