Выделение ДНК для клинической ПЦР обычно проводят с использованием либо органических растворителей (фенол, хлороформ), либо различных неорганических носителей.

а) Выделение ДНК быстрым фенольным методом:

1. Образцы для выделения ДНК (клетки или образцы тканей) ресуспендируют в 0,25 мл буфера для выделения (без РНКазы А).

2. Во время подготовки образцов смесь из 0,75 мл буфера для выделения, содержащего 0,5% саркозил, и 1 мл насыщенного буфером фенола нагревают до 65 °С. В большинстве случаев фенол высокой степени чистоты можно использовать без дополнительной перегонки. Для приготовления насыщенного буфером фенола последний расплавляют при 65°С в присутствии равного объема 0,5 М трис-НСl, pH 8,0, содержащего 0,2% 8-гидроксихинолин и 0,2% (3-меркаптоэтанол. Когда фенол полностью расплавится, тщательно перемешивают смесь, отбирают водную фазу и дважды экстрагируют фенол 0,1 М трис-НС1, pH 8,0, содержащим 0,2% p-меркаптоэтанол. После последней экстракции водную фазу не удаляют, а оставляют в сосуде с фенолом.

В таком виде насыщенный фенол может храниться при 4°С до 1 мес. Готовят 10% (вес/объем) раствор саркозила в стерильной дистиллированной воде и прогревают его при 65°С в течение как минимум 1 ч.

3. Заливают подготовленной нагретой смесью фенола с буфером образцы для выделения ДНК, осторожно тщательно перемешивают до образования гомогенной эмульсии. Продолжают экстракцию перемешиванием при комнатной температуре в течение 5 мин.

4. Центрифугируют непродолжительное время при 6000 об/мии.

5. Добавляют 1 мл смеси хлороформ — изоамиловый спирт (24:1) и продолжают экстракцию при комнатной температуре в течение 5 мин.

6. Разделяют водную и органическую фазы центрифугированием при 10 000 — 12 000 об/мин в течение 5-6 мин при комнатной температуре.

7. Переносят водную фазу и интерфазу с белками в новую пробирку.

8. Для дополнительной очистки добавляют 1 мл смеси хлороформ — изоамиловый спирт (24:1) и перемешивают при комнатной температуре в течение 5 мин.

9. Разделяют две фазы центрифугированием при 10 000—12 000 об/мин в течение 5 мин и переносят только водную фазу в новую пробирку. В водной фазе содержится растворенная ДНК.

10. Повторно добавляют смесь хлороформ — изоамиловый спирт (24:1) и после центрифугирования переносят только водную фазу в новую пробирку.

11. Добавляют к водной фазе двойной объем этанола и 1/14 объема 5М ацетата натрия для осаждения ДНК.

12. Собирают ДНК центрифугированием при высоких оборотах (10 000 об/ мин) в течение 5 мин. Супернатант отбрасывают.

13. Осадок дважды промывают 70% этанолом и высушивают в вакууме или на воздухе.

14. Растворяют ДНК в ТЕ-буфере (10 мМ трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, pH 8,0).

При таком выделении в препаратах ДНК могут присутствовать следовые количества белка, однако они обычно не влияют на последующие манипуляции (например, ПЦР или рестрикцию).

б) Выделение ДНК с использованием неорганических носителей. В настоящее время использование для выделения ДНК неорганических сорбентов считается более перспективным, чем применение фенола и других агрессивных органических веществ. Оно более технологично, не представляет опасности для исследователя. С целью выделения ДНК для клинической ПЦР используют два вида носителей или сорбентов. Одни связывают примеси, которые могут ингибировать ПЦР. Самый распространенный носитель такого типа — Chelex. Пример носителя другого типа — Silica (SiO₂), связывающий ДНК в растворе с высокой ионной силой. Связанную ДНК можно растворить, если добавить к носителю воду.

в) Выделение ДНК с использованием Chelex:

1. К образцу исследуемого биологического материала объемом 0,2 мл добавляют равный объем суспензии Chelex. Кровь, ткани или мазки перед смешиванием с Chelex можно разбавить до 30-50% суспензии или использовать без предварительной подготовки.

2. Перемешивают суспензию и инкубируют 15-20 мин при 95 °С в твердотельном термостате или на водяной бане.

3. Центрифугируют при высоких оборотах (10-13 000 об/мин.)

4. Отбирают супернатант в отдельную пробирку и используют его для проведения ПЦР.

Необходимо помнить, что такой способ выделения не дает полной очистки ДНК, а только устраняет ингибиторы ПЦР. Кроме того, происходит разбавление образца. Поэтому данную технологию следует применять, если имеет место тканевая локализация образца. Например, для определения ДНК В. anthracis образцы чаще всего берут из мест изъязвлений. В таких местах концентрация бактерий довольно высока. Кроме того, после нагревания образца с сорбентом клетки разрушаются, материал становится неинфекционным, что также важно при работе с такими патогенами, как В. anthracis.

г) Выделение ДНК с использованием Silica:

1. Образцы исследуемого биологического материала (объемом до 0,2 мл) помещают в полипропиленовые пробирки объемом 1,5 мл и добавляют 0,2 буферного раствора. В зависимости от типа патогена можно добавлять лизоцим до концентрации 0,1 мкг/мл.

2. Инкубируют при 95 °С в течение 10-15 мин для разрушения клеток и выхода ДНК в раствор. Центрифугируют при высоких оборотах (13 000 об/мин) в течение 30 мин. После центрифугирования надосадочную жидкость переносят в чистые пробирки, а осадок отбрасывают.

3. К полученному супернатанту добавляют высокосолевой раствор, содержащий 6М гуанаданизотиоционат, и 20 мкл сорбента. Инкубируют 30 мин при комнатной температуре, периодически перемешивая на смесителе типа «Vortex».

4. Затем центрифугируют 15 с на микроцентрифуге при 13 000 об/мин, надосадочную жидкость отбрасывают.

5. К осадку добавляют 0,1 мл раствора для промывки, перемешивают на смесителе типа «Vortex» и осаждают сорбент центрифугированием в течение 15 с, надосадочную жидкость отбрасывают. Промывка сорбента проводится для удаления не связавшихся с сорбентом частиц. Процедуру промывки повторяют 2 раза.

6. К осадку добавляют 0,1 мл раствора для промывки № 2, перемешивают на смесителе типа «Vortex» и осаждают сорбент центрифугированием в течение 15 с, надосадочную жидкость отбрасывают. Процедуру повторяют 2 раза.

7. Осадок подсушивают в течение 10-15 мин при 56 °С в пробирке с открытой крышкой.

8. К осадку добавляют 30 мкл деионизованной воды, перемешивают и инкубируют 30 мин при 56 °С в закрытых пробирках. Центрифугируют в течение 1 мин при 13 000 об/мин. Отобранную надосадочную жидкость переносят в чистые пробирки и используют для проведения ПЦР.

Такое выделение дает очищенный образец ДНК. Выделенная таким методом ДНК может храниться при — 20 °С в течение нескольких месяцев. Необходимо также отметить, что при данном методе выделения происходит концентрирование образца, поэтому его применяют, когда исследуют патогены, присутствующие в низкой концентрации, в частности для выявления ДНК патогенных лептоспир или ДНК М. tuberculosis, М. bovis.

- Читать далее "Техника выделения РНК для ПЦР"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 28.08.2019