Культуральный метод диагностики хламидий

Необходимые среды, реагенты, посуда, оборудование:

- среда RPMI 1640 коммерческий препарат для культивирования клеток, без антибиотиков (хранение при температуре +4°С);

- фетальная сыворотка крупного рогатого скота (хранение при -20°С);

- раствор трипсина и версена в соотношении 1:1 (хранение при + 4°С);

- 0,5М раствор стерильной глюкозы: 10,66 г глюкозы растворяют в 100 мл среды RPMI 1640, стерилизуют через фильтры Millipore (размер пор 0,45 мкм), разливают по ампулам (хранение при температуре -20°С);

- раствор циклогексимида: раствор из расчета 2 мкг/мл на среде RPMI 1640 фильтруют через фильтры Millipore (размер пор 0,45 мкм); препарат добавляют в питательную среду в количестве 1-2 мкг на 1 мл среды после заражения клеток (без последующего удаления);

- антибиотики: амфотерицин В (5 мкг/мл) и гентамицин (4 мкг/мл);

- пластиковая, одноразовая посуда для культивирования клеток и диагностического выделения хламидий;

- флаконы объемом 100-200 мл, два пластиковых культуральных стерильных матраса фирмы «Costar» площадью 25 см; стерильные 24-луночные плоскодонные планшеты фирмы «Costar», стерильные пластиковые пипетки (1;2;5;10 мл), покровные круглые стекла диаметром 12-13 мм, пенициллиновые флаконы, стеклянные бусы;

- центрифуга с бакетным (горизонтальным) ротором;

- холодильная камера на -70°С;

- инкубатор CO2;

- люминесцентный микроскоп;

- инвертированный микроскоп.

Культивирование теток McCoy. Лаборатории, использующие метод выявления хламидий в культуре клеток для диагностики инфекции, должны постоянно поддерживать рост перевиваемых клеток. При пересевах культуральную среду сливают, клетки снимают с поверхности матраса раствором версена с трипсином (5-7 мин при комнатной температуре), после удаления раствора версена с трипсином клетки суспензируют в 2 мл среды RPMI 1640.

Взвесь клеток, содержащую 1,2x10 клеток в 1 мл культуральной среды с 10% сыворотки, разливают по 1 мл в каждую лунку культурального планшета с круглыми покровными стеклами. Монослой клеток на покровных круглых стеклах формируется в течение 24-48 ч в инкубаторе CO2 при температуре 35-37°С. В процессе пересева клеток на 24-луночные планшеты 0,1 мл клеточной суспензии высаживают на матрас площадью 25 см, содержащий 7 мл среды роста (среда RPM1 1640 — 6,3 мл и 0,7 мл фетальной сыворотки).

Формирование монослоя на матрасах происходит в течение 5-7 дней. Пересеянный матрас используют для поддержания культуры клеток как для следующего опыта, так и для поддержания клеточной культуры в лабораторных условиях.

Первичный инфекционный материал, взятый от больного, помещают в стерильные флаконы со стеклянными бусами, содержащие 1 мл транспортной среды (среда RPMI с 5% фетальной сывороткой, 5% 0,5 М раствора глюкозы, 5 мкг/мл амфотерицина и 4 мкг/мл гентамицина). Инкубирование в присутствии антибиотиков проводят в течение 2-3 ч при +4°С, после чего материал помещают в морозильную камеру (температура -70°С) с целью разрушения клеток для выхода возможного возбудителя и сохранения инфекционного материала для диагностического выделения.

Заражение клеток клиническим материалом. Культуральную среду удаляют из лунок плашки. На монослой клеток, выросший на покровном стекле, вносят по 0,5 мл исследуемого материала. Плашки с материалом центрифугируют на горизонтальном роторе (2400 g 1 ч при +30-34°С). После центрифугирования плашки помещают в инкубатор CO2 на 2 ч, затем надосадочную жидкость удаляют, а стекла с монослоем клеток и адсорбированным материалом осторожно промывают 1-2 раза путем внесения и слива из каждой лунки 1 мл среды RPMI 1640.

После промывки в каждую лунку вносят 1 мл транспортной среды с циклогексимидом (цитостатик) и инкубируют при +35-37°С в инкубаторе с CO2. Оценку результатов первичного заражения клеток проводят обычно через 48-72 ч.

Критерием диагностического выделения служит выявление в зараженных клетках типичных цитоплазматических включений хламидий при окраске флуоресцирующими антителами при первичном заражении или в серии 1-2 пассажей при отсутствии бактериальной контаминации. Цитоплазматические включения представляют собой компактные или рыхло расположенные зернистые массы ярко-зеленого или желтовато-зеленого цвета, содержащие ЭТ и РТ.

Окраска культуральных препаратов. Круглые покровные стекла осторожно извлекают из лунок планшета, однократно промывают в ФСБ и высушивают при комнатной температуре на фильтровальной бумаге (клетками вверх), затем фиксируют в охлажденном ацетоне (+4°С) 10 мин при комнатной температуре. На фиксированные препараты наносят 30-50 мкл моноклональных антител, меченных ФИТЦ. Инкубируют во влажной камере при температуре +37°С 25-30 мин. После инкубации препараты промывают в ФСБ 2-3 раза (каждое стекло необходимо промывать в отдельном растворе), высушивают при комнатной температуре и помещают на каплю монтирующей жидкости на предметном стекле клетками вниз.

Лишнюю монтирующую жидкость удаляют фильтровальной бумагой. Положительным результат считается при наличии даже одного типичного ярко-зеленого цитоплазматического включения.

- Читать далее "Серологическая диагностика хламидий"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 12.2.2020

Остались вопросы или замечания?

Все размещенные статьи преследуют образовательную цель и предназначены для лиц имеющих базовые знания в области медицины.
Без консультации лечащего врача нельзя применять на практике любой изложенный в статье факт.
Жалобы и возникшие вопросы просим присылать на адрес statii@dommedika.com
На этот же адрес ждем запросы на координаты авторов статей - быстро их предоставим.