РНИФ для определения антител проводят на стекле с лунками, в которые внесены антигены (ЛГ) — контрольный и специфический. Контрольный АГ приготовлен из оболочек желточного мешка куриного эмбриона. Специфический АГ — из хламидий, выращенных в желточных мешках куриных эмбрионов, инфицированных хламидиями, собственного приготовления. АГ внесены в виде точек в лунки стекла. Стекла с АГ хранят при -200°С.

1. Нанесение образцов, инкубация. Каждое разведение исследуемых сывороток (1:16, 1:32, 1:64 и до 1:512), начиная с максимального, по 5 мкл вносят в лунки с антигенами, контрольные сыворотки (положительные и отрицательные) — в одном разведении. Стекла с сыворотками помещают во влажную камеру на 30 мин при +37°С.

2. Промывка. После инкубации материал смывают ФСБ в дезинфицирующий раствор, стекла промывают в трех сменяемых порциях ФСБ на магнитной мешалке 5-7 мин.

3. Нанесение люминесцирующей сыворотки. При промывании стекла подсушивают на воздухе (но не высушивают до конца во избежание неспецифического свечения). Вносят коммерческую сыворотку против иммуноглобулинов человека, меченную ФИТЦ, — по 5 мкл в каждую лунку. Стекла помещают во влажную камеру на 30 мин при +37"С, после чего смывают ФСБ способом, описанным выше.

4. Монтирование препарата. После высушивания на препарат наносят каплю монтирующей жидкости (забуференный глицерин: 9 частей глицерина и одна часть ФСБ с pH 7,2-7,4), лунку покрывают обезжиренным покровным стеклом. Лишнюю монтирующую жидкость и образовавшиеся пузырьки воздуха удаляют фильтровальной бумагой. Покровное стекло тщательно притирают.

5. Просмотр препарата. Условия просмотра аналогичны указанным для просмотра препаратов, окрашенных моноклональными антителами.

С каждой группой сывороток ставят следующие контроли:
- контроль на отсутствие неспецифического свечения хламидийного и контрольного АГ. АГ + ФСБ + люминесцирующая сыворотка, свечение отсутствует;
- контроль с положительной хламидийной сывороткой, наличие свечения;
- контроль с отрицательной сывороткой, свечение отсутствует.

6. Учет результатов реакции. Оценку результатов проводят по степени флюоресценции хорошо различимого комплекса АГ (ЭТ и РТ) с АТ. Интенсивность свечения оценивают по четырехкрестовой системе:
++++ — очень яркая зеленая флюоресценция ЭТ и РТ хламидий;
+++ — четкая яркая зеленая флюоресценция ЭТ и РТ хламидий;
++ — удовлетворительная зеленая флюоресценция ЭТ и РТ хламидий;
+ — крайне слабая зеленая флюоресценция ЭТ и РТ хламидий.

За титр хламидийных АТ в исследуемых сыворотках принимают то наибольшее разведение, при котором отмечается четкая яркая зеленая флюоресценция, связанная с хорошо различимыми ЭТ и РТ хламидий, не менее чем на ++. При отрицательном результате флюоресценция отсутствует.

Диагностическим титром при однократном исследовании считается разведение 1:32 или при четком нарастании титра АТ в 2-4 раза от первоначального уровня в парных сыворотках, так как однократное выявление антихламидийных АТ может быть связано не только с текущим заболеванием, но и перенесенной инфекцией хламидийной этиологии.

- Вернуться в оглавление раздела "Медицинская микробиология"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 12.2.2020